Полная нуклеотидная последовательность генома ряда нзолятов ВИЧ, следовательно, и полные последовательности аминокислот белков ВИЧ (дедуктивно рассчитанные по последовательности нуклеотидов и подтверждаемые прямым сиквенсом (определением последовательности аминокислот) были определены на редкость быстро — в первые полтора года после выделения ВИЧ в Препаративных количествах. Первые работы были выполнены н лаборатории R.C. Galto и в нескольких других лабораториях в США и в Европе, в первую очередь, в лаборатории W. Haseltine в Онкологическом институте Dana-Farber. Эти результаты получены в итоге огромного количества научно-ремесленной работы. Возможность проведения зависела не только от важности задач и усердия ученых, но главным образом, от того, что к 1980г. молекулярная биология и иммунология уже владели мощным методическим аппаратом, и в первую очередь, методами молекулярного клонирования.
Узнав о таком недуге многим людям может понадобиться Психологическая помощь профессионального психолога и коуч консультанта, статьи, консультации, бизнес тренинг, избранное.
В науке есть рабочая точка зрения, что метод решает все. При этом каждый признает, что диалектическая половина всего принадлежит идее. Но значимость наличных знаний о строении вируса, их соответствие природе вещей могут быть оценены только через понимание методов, с помощью которых добыты эти знания. Поэтому прежде чем привести сведения о составе и строении ВИЧ перечислим основные методы его изучения.
- Культивирование in vitro клонированных технологичных линий клеток, в которых ВИЧ эффективно размножается с накоплением препаративных количеств. Отбор и культивирование различных линий клеток, чувствительных к инфекции ВИЧ на которых можно изучать цитопатогенные и другие эффекты воздействия вируса и его отдельных белков.
- Выделение чистого препарата вируса, главным образом, методами ультрацентрифугирования в растворах сахарозы.
- Анализ состава вируса биохимическими методами фракционирования белков и нуклеиновых кислот, главным образом, различными видами хроматографий и электрофорезов в гелях. Определение молекулярных весов белков вируса. С целью установления наличия биохимических модификаций белков вируса, например, фосфорелирования. гликозилирования, миристилирования и т.п., в культуру клеток, в которых идет репликация вируса, вводят специфические метаболиты, меченые радиоизотопами. Затем фракционированный вирус (хроматограммы или элсктрофореграммы) анализируют методами радиоантографии, радиоиммунореципитации или другим радиоанализом и таким образом узнают, какой компонент вируса претерпевает ту или иную биохимическую модификацию.
- Получение антител, главным образом моноклональных и иногда сывороточных, против отдельных очищенных антигенов вируса или синтетических пептидов, воспроизводящих естественные антигенные детерминанты ВИЧ. Специфические антитела используют как идентификационные реагенты в самых разных вариантах иммуноанализов с целью определения наличия в материале вируса или его отдельных антигенов и генов.
- Анализ специфических противовирусных антител в крови и других биологических жидкостях людей методами иммуноферментного анализа, ралиоиммунознализа и им подобных с использованием антигенов вируса рекомбинантных и синтетических соответствующих антигенов. Анализ антител методом иммунолога (Western blot), то есть анализ связывания искомых антител с белками вируса, фракционированными методом электрофореза с переносом на твердую фазу типа нитроцеллюлозных мембран. Реакцию проявляют, как правило, иммуноферментным методом.
- Исследование морфологии и морфогенеза вируса методами электронной микроскопии тонких срезов (thin section); с негативным окрашиванием (nagative staining): туннельной электронной микроскопии; электронной микроскопии поверхностных реплик (surface replicas) и. наконец, иммуноэлектронной микроскопии с применением специфических моноклональных антител к отдельным известным компонентам вируса.
- Наиболее весомый по информационному вкладу метод исследования — молекулярное клонирование. Полное собрание ресурсов «Gold Internet» — лучшие ресурсы сети Интернет. Из инфицированных клеток (технологичных культивируемых линий) выделяют геном провируса ВИЧ. Провирусом называют интегрированную в геном клеткихозяина ДНК-копию с геномной РНК вируса. В настоящее время известно более 60 ферментов, расщепляющих ДНК в местах со строго известными последовательностями нуклеотидов (как правило, тетра- или гексануклеотидные последовательности). Эти ферменты называются рестриктазами.
Приведем список часто используемых рjстриктаз поскольку их обозначения включают в названия векторов экспрессии, которые будут встречаться и в нашем тексте: Hind III. BamH 1, Sad, EcoRl, KpnI. Srnal. Xbal, Sail Pstl Sphl. Sau3A, Mbol. Sail, PSmal. Ndel, Narl, Afllll, Aatl. Aatll, AccI, Ahall! Ahalll, Apal, AsuII, Ball. Banl, Banll. Banlll. Sstl.
Целый геном провируса или его всевозможные фрагменты встраивают с помощью определенных рестриктаз и лигаз (ферментов, сшивающих концы нуклеиновых кислот) в способные к репликации генетические конструкции. Это могут быть фаги, другие вирусы, например, вирус осповакцины или вирус папилломы быка, а также пдазмиды — кольцевые ДНК. способные к автономной от основного генома клетки репликации. В последнее время создается так мною искусственных генетических конструкций, что они не всегда могут строю соответствовать давно введенным исходным определениям плазмид или чего-то еще Поэтому в обобщенном виде искусственные генетические построения стали называть векторами экспрессии в том случае, если они содержат кроме заданного изучаемого іенетического материала комплект сервисных генов, необходимых для обеспечения репликации и индикации продукта (промотеры. энхансеры, последовательности с известными сайтами рестрикции, а также маркерные гены, кодирующие какой-либо продукт, который легко и однозначно идентифицируется). Примером часто используемого маркерного гена является ген хлорамфеникол-ацетил трансфе разы — CAT — (cloram-phenicol acctil transferase) — бактериального фермента, не встречающегося в клетках эукарнот. CAT катализирует апеллирование хлорамфеникола. В среду вводят меченый 1 С-хлорамфеникол. Наличие ацетилироваиного продукта определяют методом тонкослойной хроматографии. Вектор экспрессии вводят в клетки бактерий, дрожжей или в технологичные перевивные клетки эукарнот (насекомых, млекопитающих). Методов введения существует несколько. Если вектор экспрессии получен на основе фага или вируса, то он сам просто инфицирует адекватные клетки-мишени. Если генетическая конструкция — плазмида. то ее вводят в выбранные клетки траисфекцией с помощью преципитации фосфатом кальция или диэтидами- ноэтил-декстрамом, или элсктропорацией мембраны клетки-мишени. Живая «фабрика» нарабатывает путем пролиферации собственную биомассу и вместе с ней экзогенный вектор экспрессии и продукты трансляции с его генов. Бактериальные или эукариотические клетки-носители вектора экспрессии рассевают по одной. Это и называется клонированием. Отсюда метол в целом носит название молекулярного клонирования. Отбирают клоны клеток, нарабатывающие интересующие гены и их продукты. Отбор ведут либо методами гибридизации нуклеиновых кислот со специфическими зондами ДНК и РНК, специфичными для интересующих генов, либо по маркерному Продукту, который определяют биохимическими или иммунологическими методами. Отобранный клон клеток наращивают в массовой культуре и выделяют из них искомые гены и/или их продукты, которые называют рекомбинантными белками, в препаративных количествах, достаточных для анализа последовательности нуклеотидов (так называемого сиквенса от английского «sequence» — ряд. последовательность), а также использования рекомбинантных белков в качестве антигенов в иммунодиагностпческих тест-системах и различных экспериментальных работах.
Если Вас беспокоит зубная боль,Стоматологический форум Москва поможет от нее избавиться.
Именно методом молекулярного клонирования были выявлены многочисленные регуляторные последовательности нуклеотидов в геноме ВИЧ и регуляторные белки, которых нет в составе зрелых вирионов и которые синтезируются и функционируют в ходе репликации вируса в клетке-хозяине.
Сравнение последовательности нуклеотидов генома в различных изолятах ВИЧ, то есть клонов вируса, выделенных от разных людей и/или в разное время, показало, что процент вариаций последовательностей колеблется от 1% до 25%. Изменчивость ВИЧ необычно высока по сравнению с известными вирусологам диапазонами изменчивости других вирусов. Универсальный каталог — Киноман. Вслед за генетическими различиями соответственно варьируют и фенотипические и биологические свойства различных изолятов ВИЧ: антигенные, свойство тропизма к разным клеткам-мишеням, потенциальные возможности к репликации, качество и интенсивность цитопатогенных эффектов, продолжительность латентной стадии инфекции, чувствительность к различным ферментам рестрикции. Таким образом, можно сказать, что существует не один вирус иммунодефицита человека, а множество вирусов иммунодефицита, которые наряду с разнообразием имеют общие консервативные характеристики состава, строения и конечных биологических эффектов, то есть патогномоничные свойства, позволяющие рассматривать это множество вирусов как относительно единую таксономическую единицу. При этом параметр поразительно высокой изменчивости необходимо иметь в виду, на каждом шагу: при анализе патогенеза заболевания, при диагностике, при разработке вакцин, при подборе лекарственных средств, при сборе эпидемиологических данных и т.д.
